纳豆芽孢杆菌发酵银杏叶对肉鸡血液生化指标和抗氧化指标的影响任务书

1. 1. 毕业设计（论文）的内容、要求、设计方案、规划等

前言部分：清晰准确的描述研究意义，适当引用前人的研究进展；完整准确切入本研究的切入点；简明扼要地介绍拟解决的关键问题。

银杏叶中除了具有黄酮类化合物和萜类化合物（银杏内酯B和白果内酯）等重要药理活性成分外，还具有多糖、氨基酸、细胞色素、异戊二烯等成分，还含有25种微量元素。由于银杏叶中的很多活性成分具有独特的生理作用和调节功能，世界上大多数国家把银杏叶制剂开发的重点放在保健食品中。据资料 表明，银杏叶从原料到制剂的附加值为1：5：100（即叶子：提取物：药剂）。但与国外相比，我国在研制银杏叶成品产品方面还落后于发达国家。同时由于银杏叶提取残渣不仅带来了环保问题，也造成了极大的资源浪费。长期以来，我国在银杏叶的开发利用上仅局限于银杏叶黄酮、银杏叶内酯的药用功效，银杏叶提取物、银杏黄酮几乎成了银杏叶的代名词，而造成了银杏叶这种良好功能原料开发利用上的局限性，加之每到秋天，银杏果被采摘后，大量的银杏叶被当成垃圾废弃，造成了银杏叶资源的巨大浪费。

在现代集约化家禽生产过程中，高密度饲养及高产量要求使家禽面临着越来越多的应激因素，这些因素不断激活机体免疫系统使家禽产生免疫应激，引起营养代谢消耗增加，同时造成机体损伤。这不仅影响禽类的生长发育及其生产性能，而且还会引发各种疾病，甚至死亡。免疫应激已成为影响家禽生产和经济效益的首要问题之一，现已引起了各国学者的高度重视。依赖添加过量的抗生素和使用各种疫苗来维持生命，不但严重影响动物自身健康，而且动物食品的品质和安全也得不到保障，从而威胁人类健康。因此寻找安全有效的抗生素替代品，通过营养调控的手段，缓解免疫应激引起的生长抑制，使家禽遗传潜力得到更大程度的发挥，已受到越来越多学者的关注。近年来人们发现，大量的中草药源植物提取物已被证明具有免疫增强的作用。前人在肉鸡、鼠和兔上的试验发现，许多中草药成分能够影响机体的体液和细胞免疫反应。前人曾有研究发现，银杏叶提取物（EGB）能够改善肉鸡生产性能、促进肉鸡免疫器官的发育、在体液免疫、细胞免疫和细胞因子等各个方面均有一定的促进和调节作用。但鉴于EGB的昂贵的价格，使其在动物生产中的广泛应用受到极大的限制。

在畜牧生产中，微生物发酵是一种能够产生具有生物活性物质的有效途径，进而促进动物的生长和健康。通过微生物对中草药进行发酵处理在很久前就有若干报道，例如，Miyake等及Lin和Chiang研究发现，发酵能够改变中药的生物活性成分，增强作用效果。在畜牧生产中，若干年前，通过微生物保存饲料或液体发酵就开始在反刍动物和猪饲料中应用，且取得了良好的饲喂效果。然而，截至目前，国内外关于银杏叶发酵饲料对肉鸡生长发育的研究报道尚比较缺乏^[27]。南京林业大学以银杏叶为主要原料，运用优良的菌种，通过酶工程和微生物发酵工程，将银杏叶中动物难以消化的大分子营养源降解为易消化吸收的小分子物质，使银杏叶中固有的活性成分游离、暴露出来，更易被动物吸收。发酵后的产物除含有黄酮类化合物、银杏内酯等活性物质外，还含有大量的有益菌和高活力的复合酶。陈家祥等（2010）研究发现，日粮中添加地衣芽孢杆菌有益于肉鸡的肠道发育和盲肠微生物区系平衡，饲养前期50mg/kg添加水平，饲养后期200mg/kg添加水平显著优化了肉鸡的肠道组织结构，抑制了盲肠中有害菌的生长。周振峰（2006）研究发现，每千克精饲料中20亿单位的地衣芽孢杆菌可显著提高泌乳奶牛产奶性能，同时奶品质有所改善，并且奶牛抵抗热应激的能力增强。

国外曾有报道药用植物源发酵物对动物生产性能、血液生化指标及肉品质的影响的研究，但目前尚无以银杏叶为主要原料，以益生菌芽孢杆菌为菌株，进行固态发酵制备的产品的研究报道，本研究将制备的产品应用于肉鸡饲料添加剂中，以获得更为有效的饲喂效果。

方案拟定：实验的设计根据本课题组的方案统一进行。试验设计、材料与方法的描述要合理。

1. 纳豆芽孢杆菌银杏叶固态发酵物的制备

（1）营养盐溶液的配制：按葡萄糖2%（即每100ml营养盐中含葡萄糖2g）、尿素1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾2%、硫酸镁0.5%、硫酸铵3%的量依次称取并溶解于水中配成。

（2）发酵介质的配比：按银杏叶粉末：麸皮：玉米芯=8:1.5:0.5的比例称取后混匀。

（3）发酵培养基的准备：按每10g固体培养基加16ml营养盐溶液的比例将上述两者混合，搅拌均匀，配制成发酵培养基；将配制好的发酵培养基在121℃下灭菌50min。

（4）将发酵培养基首先接种酵母（Candida utilis）菌种（酵母菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种库，ACCC2060；采用种子液体培养法，28℃、150rpm下震荡培养），每10g发酵培养基接种酵母1ml，28℃1℃下培养121h，之后按同样的比例接种，28℃1℃下培养361h；此过程按照常规发酵方法和设备进行发酵。

（5）在低于40℃条件下完成发酵的物料干燥，粉碎即得。

2. 体内动物试验

选用1日龄（1 d）健康、体重相近的AA肉仔鸡180只（P0.05），按单因子完全随机设计分为3个处理，每个处理60只（含6个重复，每个重复10只鸡）。分别为基础日粮对照组（Contr.组）、0.3%纳豆芽胞杆菌发酵银杏叶添加组和0.6%纳豆芽胞杆菌发酵银杏叶添加组。试鸡自由采食和饮水，喂养时遵循少喂勤添的原则，采用常规管理与免疫，试验期42d。期间共进行两次称重（21和42 d），称重前一天19:00断料，不断水，第二天08:00空腹称重和结料，计算采食量（FI）、体增重（BWG）及料重比（F/G）。整个饲养过程中不饮用电解多维或与VE相关的物质。

试验日粮参照NRC（1994）建议的家禽营养需要，采用玉米-豆粕型日粮。日粮分前期（0-21d）和后期（21-42d）两个阶段，采用重量替代法配制，在不同的日粮处理组中，用同样重量的麸皮来替代等量的银杏叶发酵物，日粮组成及主要营养水平见表1。日粮组成及主要营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平（风干基础，%）

Table 1 Formulation and calculated composition of broiler diets (on fed basis, %)

注：1) *为计算值。

2) ^a：每kg饲粮提供：铁，60mg; 铜, 7.5mg; 锌, 65mg; 锰, 110mg; 碘, 1.1mg; 硒, 0.4mg; 维生素A, 4500IU; 维生素 D₃, 1000IU; 20mg; 维生素 K, 1.3 mg; 维生素 B_1, 2.2mg; 维生素 B₂, 10 mg; 维生素 B₃, 10mg; 胆碱, 400mg; 维生素 B₅, 50mg; 维生素 B₆, 4mg; 维生素H, 0.04mg; 维生素 B₁₁, 1mg; 维生素 B₁₂, 1.013mg。

实验数据采集与处理，测定的指标与方法如下：

2.1 血清生化指标的测定

血清的总蛋白和白蛋白测定采用南京建成生物工程研究所提供的商业化试剂盒进行测定。胆固醇（TC）测定采用胆固醇氧化酶-过氧化物酶终点法，甘油三酯（TG）测定采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶终点法，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量采用硫酸葡聚糖镁沉淀法（PTA-Mg² ），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL）含量采用聚乙烯硫酸盐（PVS）一步沉淀法。所有指标均用试剂盒以比色法测定。

2.2血清 T-SOD、GSH-Px、MDA等含量的测定

血清中总超氧化物歧化酶（T-SOD）采用黄嘌呤氧化法，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力按Noguchi等（1973）的方法测定，血清及肝脏中丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，总抗氧化能力（T-AOC）采用Fe³ 还原法测定。

实验数据采集与处理：详细做好实验记录，数据分析用SPSS或SAS数据分析软件。要求会用Excle进行常规作图。

结果分析：对结果与分析的描述要求准确到位。

讨论和结论：应论点明确，重点突出，不能与结果重复、离题。

2. 参考文献（不低于12篇）

指定阅读的中文参考文献如下：

[1] 曹福亮, 陈桂银, 汪贵斌, 等. 银杏叶生物饲料添加剂对黄羽肉仔鸡生长及免疫的影响[J]. 江苏林业科技, 2006, 4(33): 16-17.

[2] 陈桂银, 曹福亮, 汪贵斌, 等. 银杏叶生物饲料添加剂对黄羽肉仔鸡屠宰性能及肉品质的影响[J]. 江苏林业科技, 2006, 4(33): 18-20.

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