单一天然植物精油的抑菌活性比较研究任务书

1. 1. 毕业设计（论文）的内容、要求、设计方案、规划等

长期以来，植物精油(EO)以其独特的气味和增香作用，被广泛地应用于香精香料行业和化妆品行业。随着人们对植物精油化学成分和生物特性研究的深入，其表现出的强抑菌活性越来越得到学者的关注,成为寻找新型安全高效的天然防腐剂的重要来源之一。大量研究发现，许多植物精油具有抑菌活性强，无刺激作用，毒副作用小，安全性高的优点。因此,将植物精油开发为天然防腐剂，符合现代人们追求绿色安全生活的需求，具有巨大的潜在市场价值。

目前关于植物精油抑菌活性的报道有很多，主要集中于抑菌植物的筛选以及精油成分的分析中，并且己经筛选得到了一些抑菌活性很强的植物精油或组分。但是，己有的报道大多仅限于对单精油抑菌活性的研究，对复配精油的研究还很少。当植物精油作为天然防腐剂用于食品中时，会产生一些难以遮盖的气味，影响食品品质。因此，研究复配精油的协同作用，可以在保证抑菌效果的前提下，减少精油使用量，从而解决气味的可接受性问题。

本研究主要的研究内容是比较筛选十种天然植物精油(迷迭香、罗勒精油、牛至精油、绿薄荷精油、佛手柑精油、紫苏叶精油、薰衣草精油和艾叶精油)对四种供试菌种(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母)的体外抑菌能力，并且对筛选出的精油进行稳定性分析，包括pH值和温度的影响。随后，对所选精油的最小抑菌浓度(MIC)进行测定，旨在为植物精油在抑菌领域应用技术的开发提供科学依据。

1 试验材料与方法

1.1实验材料

1.2 试验所需菌种

细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC8739、金黄色葡萄糖球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 6633。

真菌：酿酒酵母（Saccharomylyces cerevisiae)ATCC 9763

以上菌种购自中国科学院微生物研究所(The institute of Microbiology, Chinese Academyof Sciences, IMCAS).

1.2植物精油(EO)

本实验所选八种植物精油如下，牛至精油、佛手柑精油、绿薄荷精油、紫苏精油、薰衣草精油、鼠尾草精油、广霍香精油、迷迭香精油、罗勒精油和艾叶精。

以上精油全部购自中国湖南长沙冠香日化贸易公司，所有精油都是通过水蒸汽蒸馏法制得，实验前置于低温（4℃）避光环境下保存。关于精油的细节描述列于表1中。

表1八种植物精油的细节描述

Table 1 The details of ten plant essential oils

1.3培养基

牛肉膏蛋白陈培养基(细菌)：牛肉膏3g，蛋白陈1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5-2.0g(液体培养基不含琼脂)，水1000 mL，pH为7.0-7.2之间(使用l.0mol/L的NaoH溶液调节pH)。

YPD培养基(真菌)：酵母浸粉1g，蛋白脉2g，葡萄糖2g，琼脂1.5-2.0g(液体培养基不含琼脂)，水l000mL，自然PH值。

1.4培养基的配制

按1.3中的配方分别配制牛肉膏蛋白炼培养基(固体和液体)和YPD培养基(固体和液体)，115℃30 min灭菌后待用。

1.4 菌悬浮液制备

1.4.1真菌孢子悬浮液制备

参照杜喜玲等（2011）方法。将供试菌株于斜面培养基上活化，用接种环挑取3-4环菌种到10 mL 无菌生理盐水中，然后转入无菌三角瓶中，在振荡器上振荡15秒，在用无菌纱布过滤，滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的浓度后，最后稀释至110⁶cfu/ml，用于抑菌活性测定。

1.4.2 细菌菌悬液的制备

（1）供试菌液的准备 据研究资料表明，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血念球菌和白色念珠菌的生长曲线均呈s形，在生长速度上，金黄色葡萄球菌最快，大肠埃希菌居中，白色念珠菌最慢。取对数生长期即OD值（optical density即光密度）达0.8时的5种细菌，故以培养20 h时的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型溶血念球菌液，生长30 h的白色念珠菌液作为供试菌液。

（2）菌液稀释 取少量已活化的待测菌于9 mL无菌水的试管中，充分混合，制成菌悬液，用无菌吸管取1 mL充分混合的菌悬液于试管中，加无菌水9 mL，依次制成系列浓度的菌悬液。细菌采用平板计数法，调至浓度为含孢子或菌体10¹¹~10¹²个/mL的菌悬液，用于抑菌活性测定。

1.5精油的抑菌活性-抑菌圈的测定(滤纸片法)

用打孔器将纸制成直径为6 mm的小圆纸片，干热灭菌后，备用。在灭菌的培养皿（D = 90 mm）内加入相应菌种的固体培养基15~ 20 ml，厚度约为2mm，制成营养平板，抽取供试菌悬液（10¹¹~ 10¹²）cfu/ml各100l加到相应菌的培养平板上，均匀涂布平板。然后在每个营养平板中均匀、平展放入一片滤纸片，其中在5个平板的滤纸片上分别滴加精油20L，2个平板的滤纸片上加20l无菌水、无菌甘油作对照。以上操作均在无菌条件下进行。然后将培养皿置于恒温培养箱中37℃培养24 h 后，测定金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型溶血念球菌直径，37℃培养箱内恒温培养48 h后，测定白色念珠菌抑菌圈直径。重复试验3次，取平均值。如果精油能杀死或者抑制平板中病原菌生长，则在孔的周围会出现一个无菌生长的透明圈即抑菌圈。以抑菌圈的直径作为评定指标，即抑菌圈直径越大说明该抑菌剂对此种病原菌的抑制效果越好，反之则抑制效果越差。可以先从高浓度做到低浓度，一来可以证明其有抑菌性，二来可以大概知道最低的抑菌范围（细菌置于37℃恒温培养箱中培养 24-48h，霉菌置于28℃的恒温培养箱中培养48-96h）。

1.6 pH值对精油抑菌活性的影响

用2%的Na0H和50%的柠檬酸将培养基的pH分别调为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0五个梯度，并按1.5的方法进行抑菌圈的测定，研究pH值对精油抑菌活性的影响。

2. 参考文献（不低于12篇）

指定阅读的中文参考文献如下：

[1] 胡艳芬, 江文斌, 蒋琳琳, 等. 百里香酚和香芹酚体外抑菌作用的研究[J]. 兽药与饲料, 2010, (10):107.

[2] 张静, 冯岗, 袁旭超, 等. 百里香酚抑茵活性初探[J]. 中国农业学报, 2009, 25(21): 277-280.

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